间充质干细胞治疗急性呼吸窘迫综合征的潜在作用机制探讨
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文│廖联明
编辑│陈圆圆
审校│熊叶 汤红明
廖联明 副研究员
福建医科大学协和医院中心实验室副研究员，硕士生导师。主要从事临床科研设计的教学和干细胞研究。为中华医学会医学工程学分会干细胞工程专业委员会委员、《中华细胞与干细胞杂志》《中国临床药理学杂志》编委、《医药经济报》国际新药研究信息特约撰稿人。主持或参与国家级、省部级课题研究 8 项，发表论文 100 余篇，其中干细胞相关的临床研究论文在Bone Marrow Transpl、Leukemia、Diabetes、JAMA、J Clin Oncol、Cytotherapy 等期刊上发表。急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是临床表现为双肺弥漫性浸润、进行性下降的顽固性低氧血症的临床综合征，其肺部病理表现为肺组织被大量炎症细胞浸润、肺泡塌陷、肺间隔增宽及肺泡内透明膜形成。ARDS属临床急危重症，其年发病率为75/100,000人次，病死率波动在35%至46%之间。由于发病机制不甚明了，ARDS的主要治疗方法仍为机械通气呼吸支持治疗，因此亟需新的方法来缓解和治疗ARDS。
研究表明ARDS的发病机制是机体遭受致病因素后，多种炎症细胞、细胞因子、炎症介质及趋化因子介入产生剧烈炎症级联反应导致的广泛肺损伤。急性肺损伤(acute lung injury，ALI)目前用于在动物模型中模拟的ARDS病理损伤过程。间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）因其低免疫原性、免疫调节作用以及分泌内皮和上皮生长因子的能力，在治疗ARDS上引起了人们的极大关注。近年来多个研究团队开展了关于MSC治疗ARDS的临床前研究，结果表明MSC可以促进ARDS肺泡内渗出液清除、改善肺泡-毛细血管膜通透性、降低肺内炎症级联反应等情况，对疾病的治疗具有积极的促进作用。
一、MSC的基本特征
MSC属于成体干细胞，于1968年被Friedenstein及其同事发现。它可以从多种人体组织中分离，根据其组织来源而分为骨髓MSC、脐带MSC、脂肪MSC等。2006年国际细胞治疗学会对MSC设定了3个标准：
① MSC须符合在标准的组织培养条件下能贴壁生长；
② MSC必须表达某些特定的细胞表面标志物，如CD105、CD90和CD73，但不得表达某些表面分子，包括CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79等；
③ 在体外条件下，MSC必须具有分化为不同种类细胞的能力，包括成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。
二、MSC在体内和体外ALI模型中发挥的作用
体内实验 在博莱霉素（Bleomycin）诱导的小鼠急性肺损伤和纤维化模型中，经静脉注射的小鼠MSC可通过旁分泌IL-1受体拮抗剂IL-1RA，缓解Bleomycin所致肺损伤，改善模型鼠的肺部损伤程度，提高存活率。此外，在内毒素诱导的急性肺损伤动物模型中，经气管移植MSC可以降低血浆和支气管肺泡灌洗液中促炎细胞因子的水平，并提高包括IL-10在内的几种抗炎细胞因子的水平，缓解急性肺损伤炎症程度，改善肺部水肿，提高动物存活率。
体外实验 在体外人肺组织（不符合移植标准的捐赠肺脏）灌注ALI模型和培养的原代人肺泡上皮II型细胞ALI模型上也显示出了MSC的治疗潜力。在体外人肺ALI模型中，经内毒素诱导肺损伤1小时后从支气管内灌注人MSC，可以促进肺脏对肺内渗出液的清除功能。在原代人肺泡II型细胞的培养液中加入炎性细胞因子可引起人肺泡II型细胞对蛋白质的通透性增加，而当其与MSC隔离共培养时，MSC可以通过分泌血管生成素Ang-1，抑制其蛋白通透性。
三、潜在作用机制
1. MSC定向分化及旁分泌功能
早期研究MSC治疗潜能大多源于干细胞的多能性，即可以分化为目的细胞。据报道在Bleomycin诱导的小鼠急性肺损伤模型中，静脉注射MSC，可在动物肺实质中发现注射的细胞，这些外来的细胞具有肺泡I型肺细胞的形态学特征和表型。将MSC移植到5Gy照射的C57BL/6受体小鼠中，恢复1个月后腹腔注射萘诱发急性肺损伤，2~30天后可观察到大、小气道中供体来源细胞的生长，且这些细胞表达多种上皮细胞标志蛋白。然而也有研究发现，移植后的急性肺损伤模型小鼠中只观察到数量很少（占肺细胞的比率<1%）的外源细胞。而在MSC与肺上皮A549细胞共培养的体外分化模型中，MSC可表达多种肺上皮标志物（Cytokeratin 5、8、14、18、19、前表面活性蛋白C、ZO-1），由此推测A549细胞可能通过旁分泌机制刺激MSC向内胚层上皮分化。因此认为MSC在ALI中的治疗作用更多地源于其通过旁分泌的方式分泌多种可溶性因子的能力，这些因子可以调节免疫反应，并通过释放生长因子减轻内皮或上皮细胞损伤。
2. 免疫调节
MSC的另一个主要特征是具有免疫调节功能。MSC具有强大的免疫抑制作用，可以抑制先天性和适应性免疫细胞的活性。这种免疫抑制作用可通过释放可溶性因子和细胞接触机制介导。MSC释放的免疫抑制因子包括TGF-β、PGE2、IDO、IL-10和IL-1RA等，可缓解LPS诱导的小鼠急性肺损伤导致的肺血管内皮损伤并减轻炎症细胞向肺的募集。小鼠骨髓MSC可在LPS或TNFα的刺激下分泌PGE2，刺激肺泡巨噬细胞分泌IL-10。在小鼠盲肠结扎和穿孔后的败血症模型中，MSC降低小鼠死亡率和改善器官功能的作用与MSC刺激巨噬细胞分泌IL-10有关。IL-10可以抑制中性粒细胞的黏附和经上皮迁移。在气管内大肠杆菌内毒素致急性肺损伤模型中，通过气管给予MSC后小鼠支气管肺泡灌洗液中MIP-2和TNF-α水平下降，而血浆和肺泡灌洗液中IL-10水平升高，从而提高小鼠存活率和抑制肺损伤。在Bleomycin诱导的小鼠急性肺损伤和肺纤维化模型中，MSC部分通过IL-1RA的分泌减少了肺胶原的积累、纤维化和基质金属蛋白酶的水平。IL-1RA可以与IL-1β竞争结合IL-1受体，而IL-1β是ALI患者肺内渗出液中主要的炎性细胞因子。因此MSC对实验性急性肺损伤模型中的抑制作用和其抗炎作用密切相关。
肺泡内渗出液清除障碍在ARDS患者持续性低氧血症的主要原因。生理情况下肺泡内液体清除与钠通道以及Na-K ATP酶活性密切相关。在小鼠和人肺中，肺泡内液体转运依赖于cAMP和囊性纤维化跨膜传导调节因子活性，尤其是β肾上腺素能受体驱动的肺泡内液体转运。ARDS患者的肺内渗出液中含有高浓度的促炎细胞因子，包括IL-1β、IL-8、TNF-α和TGF-β1，这些细胞因子阻碍肺内渗出液的清除。骨髓来源的MSC可以产生多种上皮特异性生长因子，特别是角质细胞生长因子（KGF）。KGF可减轻小动物模型中的肺部水种，从而改善肺损伤，降低肺损伤动物的死亡率。在大鼠的肺中，KGF通过上调钠通道蛋白α-ENaC基因表达和增强Na-K-ATP 活性改善肺内渗出液的转运。在内毒素诱导的体外灌流的人肺损伤模型中，支气管内滴注的人MSC通过分泌KGF增加肺内渗出液的清除。KGF的一些特性可以解释人MSC促进肺内渗出液清除的作用。
3. 维护肺内皮通透性
MSC的另一个可能机制是对损伤肺内皮细胞的保护作用。肺微血管内皮细胞的完整性对于降低炎症细胞和渗出液进入肺间质至关重要。MSC能分泌大量的细胞因子，如Ang-1、FGF、HGF和KGF等，这些可溶性细胞因子可参与调节肺内皮通透性。Ang-1可通过改变内皮细胞黏附分子和细胞连接，降低肺泡毛细血管膜通透性。KGF可降低肺部水肿和支气管肺泡灌洗液蛋白水平。FGF2、FGF4和FGF8负责维持内皮屏障内稳态。HGF可抑制Rho-GTPase和肌动蛋白应力纤维的形成，从而提高肺内皮细胞的完整性。
四、结论
ARDS是临床急危重症，病死率较高。鉴于MSC在ALI实验模型中的初步应用取得了令人满意的结果，人们对其在人体试验中的表现也充满期待。目前已经有多项人类临床研究在进行中，有些研究已初步显示出临床效果。但在临床试验阶段，还将面临很多问题，如MSC治疗ARDS的确切作用机制；不同分离技术、生长条件、传代次数的干细胞与疗效的关系；给药剂量和给药途径的选择；患者入排标准的确定等。通过探索这些问题将使MSC的治疗方案得到不断的优化，最终获得最佳的疗效。
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